故事发生在文艺复兴的意大利。主角Ezio Auditore是一位贵族后裔，在年仅17岁时，他的父亲和兄弟被卢米诺·德·皮齐（尼古拉·马其维利饰）指使的人杀害，他也因此成为了一名刺客。在他的师傅Mario的协助下，Ezio逐渐成长为一名刺客，并开始展开它对抗卢米诺·德·皮齐的行动。
在游戏中, Ezio 被指派来掌握制造卢米诺的瓶颈：他建造了庞大的兄弟会从威尼斯到罗马，与之同行的还有一名强大的战士她名叫毒花，她是意大利残党的领袖之一，绝对是一个就地取材不露锋芒的绝妙隐士。在刺杀德·皮齐的过程中，Ezio遇到了不止一位颇有魅力的女性，他们之间的情感纠葛也成为游戏剧情中的一大亮点。